反相色譜是目前在高效液相色譜中被廣泛應用的技術，主要原因是它適用于大多數非極性物質以及許多可離子化和離子化合物的分析。

如果某色譜柱出現污染問題，通常是因為在進行重復進樣時，強保留物質逐漸累積導致的。簡單的清洗步驟通常足以清除這些污染物，以恢復其色譜性能。在進行等度運行后，如果使用90～100%含量的溶劑B（比如甲醇、乙醚和四氫呋喃等雙溶劑反相系統(tǒng)中洗脫能力較強的溶劑）沖洗20個柱體積，即可清除污染物。需要注意的是，色譜柱的柱體積和空柱管體積是不同的概念，例如一根4.6x250mm的柱子的柱體積只有2.5ml，而2.1x150mm的柱子則只有0.28ml的柱體積。

若采用緩沖鹽系統(tǒng)，請勿直接切換至強溶劑，因為突然切換至高濃度有機溶劑可能會導致緩沖鹽在HPLC流動體系中沉淀，進而引起更嚴重的問題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉軸失靈。建議先使用無緩沖鹽流動相(即用水代替緩沖液)，沖洗5 ~ 10個柱體積，然后再切換至強溶劑清洗。

某些情況下，即便使用強溶劑B，也難以清除附著在色譜柱上的污染物。此時就需要運用更為強力的溶劑，或采用一系列溶劑的組合。

如果污染物不是生物質的，一種強效溶劑或者幾種溶劑組合的清洗方法基本可以解決問題。許多柱子生產廠家的官網和產品說明書上也會提供清洗方法的推薦。

所有清洗方法的步驟通常相似，使用的溶劑強度會逐漸增加，最后一個溶劑通常會是非極性非常強的，例如醋酸乙酯或者烷烴，以便溶解非極性污染物如脂質和油類。每個溶劑在系列中都要確保與下一個溶劑互相溶解。

在完成整個清洗過程后，必須采用一種中等強度、互溶性非常好的溶劑來過渡回到原來的流動相體系。例如，我們可以選用異丙醇作為過渡溶劑，因為它既能與正己烷或二氯甲烷互溶，也能與水相溶劑互溶。然而，由于異丙醇的粘度很高，我們需要保持較低的流速，以避免造成泵壓過高的情況。