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手性色譜柱怎么用，七步搞懂！

欄目：行業(yè)資訊 發(fā)布時(shí)間：2024-07-18
手性色譜柱是液相色譜分析制備中經(jīng)典的耗材，如何正確使用手性色譜柱、延長(zhǎng)手性色譜柱的使用壽命？拿到新的色譜柱我們應(yīng)該干什么？還不知道的就跟小研一起來(lái)看看吧。
手性色譜柱是液相色譜分析制備中經(jīng)典的耗材，如何正確使用手性色譜柱、延長(zhǎng)手性色譜柱的使用壽命？拿到新的色譜柱我們應(yīng)該干什么？還不知道的就跟小研一起來(lái)看看吧。

01
色譜柱構(gòu)造

在使用手性色譜柱之前，讓我們先來(lái)了解一下手性色譜柱的基本結(jié)構(gòu)。色譜柱是由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。
（圖源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪）


色譜柱柱管通常由不銹鋼、玻璃或聚合物材料制成，以確保足夠的機(jī)械強(qiáng)度和耐腐蝕性。


柱管的內(nèi)徑和長(zhǎng)度根據(jù)應(yīng)用需求有所不同，分析柱基本的內(nèi)徑范圍為2.1mm到4.6mm，長(zhǎng)度從50mm到250mm不等，最常用的規(guī)格是4.6*250mm。

壓帽用于固定填料，防止填料在使用過(guò)程中泄漏。

篩板則用于支撐填料，確保流動(dòng)相能均勻流過(guò)。

02
固定相

固定相又稱(chēng)為色譜填料，是色譜柱的核心，是色譜分析的關(guān)鍵部分。在色譜分析中，流動(dòng)相攜帶樣品通過(guò)色譜柱，樣品中的各組分在固定相與流動(dòng)相之間發(fā)生分配、吸附、解吸等過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)組分的分離。分離后的組分隨流動(dòng)相流出色譜柱，經(jīng)檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)后得到色譜圖。

手性固定相的類(lèi)型有以下幾種：

  1. 多糖類(lèi)：主要有纖維素型與直鏈淀粉型
    2. 纖維素由 β-D-葡萄糖單元通過(guò) 1,4-糖苷鍵連接而成的線(xiàn)狀聚合物。結(jié)構(gòu)高度有序、呈螺旋型空穴結(jié)構(gòu)的光學(xué)活性天然高分子。

    直鏈淀粉由 α-D-葡萄糖單元通過(guò) 1,4-糖苷鍵連接而成，存在一個(gè)左手四重螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)更為有序。直鏈淀粉的螺旋比纖維素要更大、更規(guī)律且更為剛性。

  2. 環(huán)糊精類(lèi)
    3. 環(huán)糊精（Cyclodextrin，簡(jiǎn)稱(chēng)CD）是由直鏈淀粉經(jīng)酶發(fā)酵生成的一類(lèi)寡糖化合物，常用的有α，β和γ-環(huán)糊精，分別包含6、7 和8個(gè)葡萄糖單元，其中β-環(huán)糊精應(yīng)用范圍最廣。因?yàn)?/span>β-環(huán)糊精溶解度最好、剛性最強(qiáng)，疏水性空洞內(nèi)可嵌入各種對(duì)映體分子，形成包絡(luò)復(fù)合物，對(duì)手性分離有良好的選擇性，因此其衍生后特別適合芳香型化合物的手性分離。

  3. 蛋白質(zhì)類(lèi)
    4. 如BSA牛血清蛋白，氨基酸殘基可提供手性位點(diǎn)，手性藥物對(duì)映異構(gòu)體與手性位點(diǎn)可以產(chǎn)生不同作用力，如氫鍵、疏水作用、靜電作用等，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)映體拆分。
    BSA作為甲氨蝶呤的專(zhuān)用柱，已寫(xiě)進(jìn)中國(guó)藥典。

  4. 其他手性固定相
    如大環(huán)類(lèi)（抗生素及冠醚）、配體交換型、分子印跡聚合物等……



03
流動(dòng)相
流動(dòng)相體系的選用是與固定相之間形成一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，使得在流動(dòng)相的洗脫下對(duì)映異構(gòu)體得到分離。

選定色譜柱后，可選用的溶劑種類(lèi)就有了一個(gè)范圍，在色譜柱溶劑使用的范圍內(nèi)進(jìn)行流動(dòng)相體系的依次篩選。

首先使用常規(guī)流動(dòng)相，如在正相體系下，優(yōu)先選擇正己烷、異丙醇、乙醇等的流動(dòng)相，而反相體系下，優(yōu)先選擇乙腈、水、甲醇作為流動(dòng)相。如拆不開(kāi)再選用非常規(guī)的流動(dòng)體系，如二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯等。

但需要注意的是：涂覆型手性固定相禁用強(qiáng)溶劑作為流動(dòng)相，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯以及丙酮等，否則會(huì)使多糖衍生物溶解或溶脹，破壞固定相，只能用非極性烷烴和醇作為流動(dòng)相。

此外，流動(dòng)相體系還可以添加緩沖鹽，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度，從而影響手性化合物與手性固定相之間的相互作用，提高分離度和改善峰形。常用緩沖鹽主要有：磷酸鹽、銨鹽、硼酸鹽等。

04
新柱使用前的注意事項(xiàng)


1.新柱安裝：在使用新色譜柱之前，確保系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物 。

對(duì)于正相手性色譜柱，出廠(chǎng)保存條件為正己烷/異丙醇=90/10。使用時(shí)，請(qǐng)先用正己烷/異丙醇=90/10 沖洗色譜柱30 min，再更換為目標(biāo)流動(dòng)相穩(wěn)定系統(tǒng)至基線(xiàn)平穩(wěn)。


而反相手性色譜柱的色譜柱出廠(chǎng)保存條件為乙腈/水=90/10。使用時(shí)，請(qǐng)先用乙腈/水=90/10沖洗色譜柱30min，再更換為目標(biāo)流動(dòng)相穩(wěn)定系統(tǒng)至基線(xiàn)平穩(wěn)。


2.使用合適試劑：接入手性色譜柱前，須先用合適的溶劑沖洗流路（包括流通閥、定量環(huán)和自動(dòng)進(jìn)樣器）。

注意：部分溶劑（如丙酮、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氫呋喃等）強(qiáng)溶劑會(huì)破壞涂覆型手性固定相的結(jié)構(gòu)，因此不得使用它們作為流動(dòng)相或溶劑溶解樣品。


3.逐步提高流速：當(dāng)溶劑均勻的從柱出口端流出，停流速，將色譜柱出口端接到系統(tǒng)檢測(cè)器上，然后逐步提高流速至常規(guī)分析時(shí)所使用的流速。

05
色譜柱保養(yǎng)


1.定期測(cè)試：定期進(jìn)行柱效測(cè)試，記錄理論塔板數(shù)、分離度與壓力，從而追蹤監(jiān)控色譜柱的性能變化。
2.保存條件：

正相手性色譜柱在使用含酸/堿添加劑的正相流動(dòng)相后，需用正己烷/異丙醇=90/10沖洗色譜柱30min，然后用正己烷/異丙醇=90/10封存。

反相手性色譜柱在使用含酸/堿添加劑的反相流動(dòng)相后，需用乙腈/水=90/10 沖洗色譜柱30min，然后用乙腈/水=90/10封存；使用含緩沖鹽流動(dòng)相后，需要用不含緩沖鹽同比例流動(dòng)相沖洗色譜柱30min，然后用乙腈/水=90/10封存。

3.避免極端條件：色譜柱應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間處于極端pH或高溫條件下，這可能會(huì)導(dǎo)致色譜柱性能下降或老化 。

4.進(jìn)樣前注意事項(xiàng)：


進(jìn)樣前需過(guò)濾樣品溶液。


必須使用色譜級(jí)試劑配制流動(dòng)相，使用前需經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾和超聲脫氣處理。


反相流動(dòng)相一般使用甲醇、乙腈、水，流動(dòng)相允許的最高有機(jī)相比例為100%；最高的水相比例為60%。

06
pH適用范圍

以廣州研創(chuàng)手性色譜柱為例，pH適用范圍為2～8，手性固定相對(duì)手性化合物分離的選擇性主要依賴(lài)于立體選擇性相互作用，如氫鍵、π-π相互作用等，這些相互作用對(duì)pH值較為敏感，通常推薦在中性或接近中性的pH條件下使用，以避免對(duì)固定相的損傷或影響手性分離效果。



07
使用保護(hù)柱

保護(hù)柱對(duì)于確保手性色譜柱的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行和延長(zhǎng)其使用壽命非常重要。保護(hù)柱能夠預(yù)先捕獲可能堵塞分析柱的顆粒物和其他雜質(zhì)，從而避免對(duì)分析柱造成損害。

此外，選擇保護(hù)柱時(shí)，應(yīng)確保保護(hù)柱的填料與分析柱的填料一致，以保證選擇性的一致性。保護(hù)柱的規(guī)格，包括填料粒徑和內(nèi)徑，也應(yīng)與分析柱相匹配。