在化學(xué)的廣闊領(lǐng)域中，手性分子以其獨(dú)特的性質(zhì)和廣泛的應(yīng)用吸引了眾多科學(xué)家的關(guān)注。從藥物研發(fā)到材料科學(xué)，手性方法的開發(fā)不僅是科學(xué)研究的前沿，也是技術(shù)創(chuàng)新的重要方向。今天，小研就來跟大家聊聊手性方法開發(fā)的一些小知識(shí)，走進(jìn)這個(gè)充滿奧秘的世界。手性分子，是化學(xué)中結(jié)構(gòu)上鏡像對(duì)稱而又不能完全重合的分子。碳原子在形成有機(jī)分子的時(shí)候，4個(gè)原子或基團(tuán)可以通過4根共價(jià)鍵形成三維的空間結(jié)構(gòu)。由于相連的原子或基團(tuán)不同，它會(huì)形成兩種空間構(gòu)型不同的分子結(jié)構(gòu)，兩者的物理化學(xué)性質(zhì)相同，但是在生理藥理性質(zhì)上卻可能有很大差異，在藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)等方面往往存在差別，有的甚至作用完全相反。從分子的空間結(jié)構(gòu)來看，它們是兩種分子。由于是三維結(jié)構(gòu)，它們像是左手和右手、鏡子里和鏡子外的物體那樣，看上去互為對(duì)映，但不管怎樣旋轉(zhuǎn)都不會(huì)重合。因此這兩種分子具有手性，是手性分子，它們互為同分異構(gòu)體，這種手性異構(gòu)形式分為R型和S型。
用于判斷空間結(jié)構(gòu)是否具有對(duì)稱性的參數(shù)有：對(duì)稱中心、對(duì)稱軸、對(duì)稱面和交替對(duì)稱軸。其中對(duì)稱軸的有無，對(duì)分子是否具有手性沒有關(guān)鍵性影響，而具有對(duì)稱中心、對(duì)稱面和交替對(duì)稱軸的化合物若可以與其鏡像重合，則為非手性分子；反之，則為手性分子。
還有一個(gè)判斷分子是否具有手性的簡(jiǎn)單方法，那就是判斷手性碳原子是否存在：一個(gè)碳原子上連著四個(gè)互不相同的基團(tuán)，空間上有兩種不同的排列結(jié)構(gòu)，這種碳原子稱為手性碳原子。一般來說，手性化合物一定具有手性碳原子（也有手性氮原子和硫原子的存在），但如果一個(gè)化合物具有兩個(gè)手性中心，那么此化合物可能為內(nèi)消旋體，沒有手性現(xiàn)象。
手性色譜柱是通過手性固定相與化合物之間作用力的差別來實(shí)現(xiàn)對(duì)映異構(gòu)體的分離，隨著手性固定相有了越來越多的種類，目前大部分手性化合物都是用手性色譜柱進(jìn)行分離。
手性化合物與手性衍生試劑反應(yīng)，使得一種構(gòu)型與其對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)生物理性質(zhì)的差異，從而可以在反相色譜上根據(jù)分配比的不同實(shí)現(xiàn)手性異構(gòu)體的分離。此種方法隨著手性固定相的開發(fā)，占據(jù)的優(yōu)勢(shì)越來越小。將手性試劑加入到流動(dòng)相中，在洗脫過程中，手性試劑與對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合，形成非對(duì)映異構(gòu)體，從而實(shí)現(xiàn)在固定相中保留時(shí)間的差異，達(dá)到分離的目的。根據(jù)固定相的不同，目前市場(chǎng)上所售的手性色譜柱有以下類型：1）多糖衍生物類色譜柱：此類固定相為纖維素衍生物和直鏈淀粉衍生物，適用于含有酰胺基、芳香環(huán)取代基、羰基、硝基、磺?；?、氰基、羥基、氨基等化合物的手性分離。2）環(huán)糊精類色譜柱：異構(gòu)體分子可嵌入環(huán)糊精疏水性空洞內(nèi)形成包絡(luò)復(fù)合物，衍生后特別適合芳香型化合物的手性分離。3）蛋白質(zhì)類手性色譜柱：固定相為特定酶類蛋白質(zhì)，主要分離具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的伯胺和仲胺的化合物，用于反相色譜。4）冠醚類手性色譜柱：固定相為冠醚類手性固定相，主要分離氨基酸及手性中心有氨基的化合物。5）其他色譜柱：離子交換色譜柱，配體交換色譜柱，多用于氨基酸及其衍生物對(duì)映異構(gòu)體的分離。上述的色譜柱的應(yīng)用范圍最廣的當(dāng)屬多糖衍生物類的色譜柱，可以分離目前市面上80%以上的已知手性藥物。
對(duì)于藥物研發(fā)中小分子化合物的手性分離，最多采用的色譜柱為多糖衍生物類色譜柱，此類手性色譜柱應(yīng)用廣泛，可分離的化合物種類多，因此就針對(duì)此類手性色譜柱方法開發(fā)的幾個(gè)重要因素進(jìn)行表述：多糖衍生物類手性色譜柱的固定相主要分為：纖維素衍生物和直鏈淀粉衍生物。兩者的空間結(jié)構(gòu)均是螺旋型腔體，該腔體對(duì)化合物分子有包含作用力。而直鏈淀粉的空間結(jié)構(gòu)比纖維素的空間結(jié)構(gòu)要更大、更規(guī)律，作用力稍強(qiáng)一些。此外，多糖衍生物類色譜柱又分為鍵合型和涂敷型兩種，鍵合型色譜柱對(duì)于流動(dòng)相體系的可選范圍更大，能夠耐受各種強(qiáng)溶劑，且不易發(fā)生柱流失。流動(dòng)相體系的選用是與固定相之間形成一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，在流動(dòng)相的洗脫下將對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行分離。選定色譜柱后，可選用的溶劑種類也有了一個(gè)范圍，在色譜柱溶劑使用的范圍內(nèi)進(jìn)行流動(dòng)相體系的依次篩選。在篩選的初步，首先使用常規(guī)流動(dòng)相，例如正己烷，正庚烷，異丙醇，乙醇等的流動(dòng)相，再選用非常規(guī)的流動(dòng)相體系，如二氯甲烷，乙酸乙酯等。選定了流動(dòng)相以后，再進(jìn)行流動(dòng)相比例的調(diào)節(jié)。由于基線漂移問題，在正相體系中一般多采用等度洗脫模式，而較少采用梯度洗脫，梯度洗脫基線變化非常大，容易出現(xiàn)不明峰。第三，色譜參數(shù)的調(diào)節(jié)1）流速的調(diào)節(jié)：通常色譜柱會(huì)提供一個(gè)建議流速，例如1mL/min，但有時(shí)在此條件下分離度不夠，那么可以降低流速使得分離度合格。2）柱溫的調(diào)節(jié)：通常條件下，低溫有利于分離，因?yàn)榈蜏叵聜髻|(zhì)阻力減弱，流動(dòng)相的粘度增大，更有利于異構(gòu)體分離，但是也有例外情況，有的化合物對(duì)溫度敏感，柱溫會(huì)影響化合物的分離。3）波長(zhǎng)的選定：手性方法開發(fā)中，波長(zhǎng)的選用相對(duì)較為簡(jiǎn)單，選擇的標(biāo)準(zhǔn)是吸光度相同，且該波長(zhǎng)下吸光度穩(wěn)定，則方法的耐用性良好。一般會(huì)選擇化合物的最大吸收波長(zhǎng)，但若方法中使用了添加劑，那么波長(zhǎng)的選用應(yīng)大于添加劑的截止波長(zhǎng)，避免基線影響檢測(cè)。4）濃度選定：根據(jù)選定波長(zhǎng)下異構(gòu)體的峰高和峰寬情況，確定檢測(cè)的靈敏度，進(jìn)而確定測(cè)定濃度。色譜參數(shù)的調(diào)節(jié)需要我們研發(fā)工作者針對(duì)不同化合物進(jìn)行獨(dú)立探討和實(shí)驗(yàn)，最后確定最終的參數(shù)。對(duì)于剛開始入門的所有的分析人員來說，可能希望找到一種模式，使得對(duì)所有的化合物都有效，比如，低溫一定有助于分離，異丙醇一定比乙醇的體系分離度好等等。但實(shí)踐出真知，科學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該具體問題具體分析。
添加劑可以分為酸性添加劑和堿性添加劑。加入添加劑的目的有兩個(gè)：第一，有效改善峰形，色譜硅膠填料的性質(zhì)決定了加入堿性添加劑，可以起到掃尾的作用；第二，調(diào)節(jié)pH可以改善樣品在溶劑中官能團(tuán)的解離。
那么如何選擇酸堿添加劑？
1）堿性化合物首選堿性添加劑，例如三乙胺 、二乙胺等，添加堿性添加劑可以有效地防止化合物和硅羥基之間的相互作用而引起的拖尾現(xiàn)象。
2）酸性化合物首選酸性添加劑：例如三氟乙酸，醋酸等，多糖衍生物類手性固定相的極性較大，酸性化合物可能與固定相的結(jié)合過牢，從而導(dǎo)致色譜峰洗脫不出來，或者峰形嚴(yán)重拖尾，加入酸性添加劑可以有效抑制化合物的解離，實(shí)現(xiàn)化合物的分離。
色譜柱都有pH的耐受上限，每一款不同的色譜柱的說明書上都標(biāo)有最高酸堿添加量，若是超過上限則會(huì)對(duì)色譜柱的壽命有很大影響。
多糖衍生物可以在水中和鹵代烷烴中溶解，手性方法開發(fā)過程中應(yīng)避免使用這一類溶劑（特殊處理工藝的色譜柱除外），所以常規(guī)條件的流動(dòng)相多選用烷烴和醇類。在正相色譜中，固定相極性較大，那么醇類為強(qiáng)洗脫性溶劑，烷烴類為弱洗脫性溶劑。進(jìn)行方法開發(fā)時(shí)，首選正己烷和乙醇，這一組體系不能將化合物進(jìn)行分離，將乙醇更改為異丙醇或者正丙醇，或者將正己烷改為正庚烷，可能會(huì)有很大的改善，也可能效果不明顯，每一種化合物和溶劑之間的相互作用需要不斷的嘗試。在整體的研發(fā)中，可能會(huì)遇到相互矛盾的情況出現(xiàn)。例如：異構(gòu)體的分離度不夠，流動(dòng)相中增高烷烴的比例，分離度合格了，但該比例下靈敏度的信噪比太小，靈敏度和分離度之間形成了矛盾，此時(shí)應(yīng)嘗試改變柱溫或變更流動(dòng)相體系來滿足分離的要求。
結(jié)語
在實(shí)驗(yàn)室不能提供很多的色譜柱及項(xiàng)目時(shí)間緊張的情況下，可以將樣品送到國(guó)內(nèi)專門生產(chǎn)手性色譜柱的廠家——廣州研創(chuàng)，進(jìn)行方法開發(fā)摸索可以省時(shí)省力，也不失為一個(gè)便捷的方法。手性方法開發(fā)中的小知識(shí)就先分享這些，歡迎大家一起來探討學(xué)習(xí)。咨詢、訂購(gòu)歡迎聯(lián)系：18922204815/020-32051815。
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