手性固定相在高效液相色譜（HPLC）中扮演著實(shí)現(xiàn)對映體拆分的關(guān)鍵角色。其中，蛋白質(zhì)類手性固定相因其獨(dú)特的性質(zhì)而備受關(guān)注。今天小研帶大家一起來了解一下這類獨(dú)特的蛋白質(zhì)類手性固定相~

蛋白質(zhì)（protein）根據(jù)20種氨基酸側(cè)鏈R基團(tuán)的極性，可將其分為非極性R基氨基酸（8種)、不帶電荷的極性R基氨基酸（7種）、帶負(fù)電荷的R基氨基酸（2種）和帶正電荷的R基氨基酸（3種）。

自然界的生命存在于由生物大分子組成的手性環(huán)境中，酶和受體系統(tǒng)總是顯示出對映體選擇性或立體選擇性。蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的高分子聚合物，所含亞單位L-氨基酸具有手性特異性，能特異性地結(jié)合小分子，因此對手性分子具有很強(qiáng)的識別能力。然而，只有有限的一些蛋白質(zhì)被系統(tǒng)研究而被制備成手性固定相。

目前，用于手性拆分的蛋白質(zhì)按其來源可分為:

白蛋白類：包括牛血清蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)；

1.1 牛血清蛋白（BSA）

牛血清蛋白

牛血清蛋白（BSA）是球狀蛋白，由581個(gè)氨基酸組成的單鏈，鏈內(nèi)有17個(gè)二硫橋鍵，分子量為66210，分子量較小、溶解性較大、穩(wěn)定性較好、和各種配體的親合性較好、易于分離提純和大量制備；更為重要的是牛血清蛋白具有對某些氨基酸衍生物和藥物異構(gòu)體可提供手性位點(diǎn)，手性藥物對映異構(gòu)體與手性位點(diǎn)可能產(chǎn)生不同作用力，如氫鍵疏水效應(yīng)和靜電作用等，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對映體拆分，從而被用于HPLC手性分離。

以廣州研創(chuàng)獨(dú)家專利產(chǎn)品——EnantioPak? BSA牛血清蛋白手性色譜柱為例，它是反相專用柱，其固定相是牛血清蛋白，適用于水溶性化合物、氨基酸類、伯胺類的測定。

EnantioPak? BSA也是甲氨蝶呤的專用柱，根據(jù)《中國藥典2020年版》中甲氨蝶呤的檢測方法，用牛血清蛋白手性色譜柱可檢測其光學(xué)純度，使用廣州研創(chuàng)EnantioPak? BSA按照高效液相色譜法做了全面的驗(yàn)證，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，可滿足檢測要求。

廣州研創(chuàng)專利的這款EnantioPak? BSA牛血清蛋白柱除了可以用于檢測甲氨蝶呤，還可用于拆分酒石酸鹽、磷酸奧硝唑酯二鈉、甲基四氫葉酸鈣、匹多莫德、色氨酸、磷酸特地唑胺、惡唑烷酮類抗菌劑等等。目前主要有分析柱及保護(hù)柱，可以去根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求去選擇。（詳情請咨詢18922204815）

1.2人血清白蛋白(HSA)

人血清白蛋白(HSA)與 BSA 的性質(zhì)非常相似，HSA 也是一種球狀蛋白，分子量為 66437，等電點(diǎn)為4.7，它是一條含有17個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的單肽鏈。它能拆分一些弱酸或中性化合物的對映異構(gòu)體，其中包括芳基丙酸類非甾體抗炎類藥物，還原葉酸如亞葉酸5-甲基四氫葉酸，苯并二氮草如去甲羥基安定、羥基安定和勞拉西泮。

②糖蛋白類：包括α1-酸性糖蛋白(α1-AGP)、卵類黏蛋白(OVM)和卵蛋白(AVI)、黃素蛋白(FP)；

2.1α1-酸性糖蛋白(α1-AGP)

α1-酸性糖蛋白是由181個(gè)氨基酸和5個(gè)雜多糖組成的單鏈多肽，包含14個(gè)唾液酸殘基，平均分子量為33000，糖含量約34%。因其較低的等電點(diǎn)（pl 2.7)，成為結(jié)合陽離子藥物的主要血漿蛋白。許多堿性、中性和酸性對映體都能在AGP柱上得到拆分。

2.2卵類黏蛋白(OVM)

卵類粘蛋白也被用作手性固定相。雞卵類黏蛋白作為蛋白質(zhì)手性固定相可以拆分藥物和體液中的酸、堿、中性對映異構(gòu)體化合物。該柱的穩(wěn)定性優(yōu)于其他蛋白質(zhì)類手性固定相。

③酶類：包括纖維素酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、葡聚糖纖維二糖水解酶(CBH)、胃蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、溶菌酶；

3.1纖維素酶

纖維素酶是具有不同的結(jié)構(gòu)但都具有水解1,4-糖苷鍵功能的一組酶家族。由真菌瑞氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶 CBH I和CBH II 為酸糖蛋白。CBH I固定相能拆分酸性、堿性及不帶電荷的消旋體，對于拆分受體阻斷劑選擇性尤其高。而CBH II對β-受體阻斷劑選擇性不如CBH I，但能拆分其他的消旋體。

3.2胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶

兩者都屬絲氨酸蛋白酶家族、催化氨基化合物和脂類對映體的選擇性水解。胰蛋白酶固定相能拆分O-和N,O-衍生化的氫基酸，這兩類氨基酸都是該酶的底物，手性識別位點(diǎn)也正位于酶的活性中心，這提示立體選擇性拆分是酶的活性作用的結(jié)果。α-凝乳蛋白酶 固定相能拆分氨基酸、氨基酸生生物、二肽及其他的一些化合物如萘普生和芳氧基丙酸類。

3.3淀粉葡萄糖苷酶

淀粉葡萄糖苷酶能對幾種β-受體阻斷劑的消旋體進(jìn)行拆分，流動(dòng)相pH>6有助于提高拆分選擇性。

3.4胃蛋白酶和溶菌酶

這兩種蛋白的固定相均能拆分堿性和不帶電的對映體，但不能拆分酸性對映體。當(dāng)流動(dòng)相pH>7時(shí)，胃蛋白酶柱會失去手性識別特性并發(fā)生不可逆性的變性。

④其他蛋白：卵傳鐵蛋白和β-乳球蛋白。

多數(shù)蛋白質(zhì)類手性固定相的分離機(jī)制目前尚不十分清楚，但是蛋白質(zhì)類手性固定相的手性識別能力可以歸結(jié)為它們獨(dú)特的一、二和三級結(jié)構(gòu)特征。尤其是在對映體的手性識別過程中，三級結(jié)構(gòu)所創(chuàng)造的疏水性口袋、溝槽或通道對非對映絡(luò)合物的形成常常是十分重要的。

蛋白質(zhì)類手性固定相的作用機(jī)制主要是通過疏水和極性相互作用進(jìn)行手性拆分。當(dāng)對映體進(jìn)入色譜柱后，它們會與固定相上的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。由于蛋白質(zhì)的手性識別能力，不同的對映體會與蛋白質(zhì)形成不同的結(jié)合方式和強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)手性拆分。

四、影響蛋白質(zhì)手性固定相拆分效果的因素

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)在很大程度上影響其立體選擇性，因而其固定化狀況極大地影響手性藥物的拆分。同時(shí)由于蛋白質(zhì)易變性，通常只能用溫和的水相緩沖液作流動(dòng)相，對柱溫也有一定的要求。

1.固定化狀況 

固定化方法、載體的物理性質(zhì)、鍵合反應(yīng)基團(tuán)的空間長度、鍵合到柱載體上的蛋白質(zhì)的量以及蛋白質(zhì)提取和純化方法等均影響固定相的手性選擇性。蛋白質(zhì)固定化方法可影響蛋白質(zhì)提供的手性識別位點(diǎn)，并使其與對映體間產(chǎn)生不同的疏水作用。如將BSA 鍵合到硅膠上比吸附到硅膠上更具手性選擇性。載體硅膠的孔徑、鍵合反應(yīng)基團(tuán)的空間長度會直接影響鍵合到柱載體上的蛋白質(zhì)的量，可能導(dǎo)致不同程度的手性或非手性作用其中手性作用源于蛋白質(zhì)提供的手性識別位點(diǎn)，非手性作用來自于未被覆蓋的載體基團(tuán)。

2.流動(dòng)相的pH值 

流動(dòng)相的pH值是一個(gè)最重要的參數(shù)，它不僅決定了溶質(zhì)的電離程度，同時(shí)會改變蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)影響其親和性和手性特性。若溶質(zhì)離子化程度減少，與固定相的親和力就會增加保留值增加。

3.有機(jī)改性劑 

在流動(dòng)相中加入少量改性劑能影響溶質(zhì)在柱上保留行為和手性作用，這是改性劑和溶質(zhì)競爭固定相上鍵結(jié)合位點(diǎn)或者改變蛋白質(zhì)疏水性的結(jié)果。常用的改性劑可分為四類：中性有機(jī)改性劑，如乙醇、丙醇、乙腈等陽離子有機(jī)改性劑。

4.色譜柱溫度

升高柱溫可增加理論塔板數(shù)，改善柱效。但同時(shí)，柱溫變化可改變離子平衡狀況，如改變?nèi)苜|(zhì)的電離狀態(tài)、導(dǎo)致蛋白質(zhì)固定相結(jié)構(gòu)改變等，最終改變?nèi)苜|(zhì)同固定相的手性作用力。

下期預(yù)告：刷型手性固定相，敬請期待~